一、从单分子到高通量—法医遗传学测序技术的演进

在法医遗传学领域，DNA测序技术是破解生物证据密码的核心工具。自1977年桑格链终止法（一代测序技术）问世以来，其凭借高精度优势成为个体识别、亲权鉴定等领域的核心工具。然而，随着犯罪形态复杂化、微量降解样本增多，传统技术在通量和多标记检测上的局限性逐渐显现。21世纪初兴起的二代测序技术（NGS），以“高通量、低成本、多维度”的特性掀起技术革命，推动法医遗传学从单基因分析迈向全基因组时代。

二、从单分子延伸到大规模平行测序的底层逻辑

一代测序技术：桑格法的单分子精准解码

桑格链终止法基于双脱氧核苷酸（ddNTP）对DNA合成的特异性终止作用，通过4组独立反应分别掺入ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，生成不同长度的DNA片段，经毛细管电泳分离后读取序列。其核心优势在于单分子反应的高idelity（准确率> 99.99%）和长读长（600-1000 bp），但单次反应仅能分析单个片段，通量极低（单次运行≤96样本），且依赖放射性标记或荧光标记的复杂前处理，难以满足大规模案件筛查需求。

在实际操作中，研究人员会先将待测序的DNA模板、DNA合成酶、dNTP、引物、缓冲液等混合在反应体系中，然后分别加入少量带有放射性（如P32）或荧光标记的四种ddNTP。引物与模板链结合后，DNA聚合酶按照碱基互补配对的原理，将dNTP添加到引物后面进行延伸。当ddNTP随机掺入正在合成的DNA链上时，由于其缺少3’-OH，无法与下一个脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，导致DNA聚合反应终止 。这样，在4个同时进行的反应系统中，就会产生一系列以特定碱基结尾的不同长度的DNA片段。反应结束后，将这些片段分4个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（早期方法）或毛细管电泳（荧光自动测序技术）。经过放射自显影（放射性标记时）或检测荧光信号（荧光标记时），根据片段末端的碱基，反向依次就能阅读出DNA的碱基排列顺序。例如，在早期的人类基因组计划中，桑格测序法发挥了重要作用，为后续的基因研究奠定了基础。但在面对大规模的法医样本时，其通量低的缺点就暴露无遗，难以在短时间内处理大量样本。

二代测序技术：高通量测序的并行化革新

二代测序以Illumina的边合成边测序（SBS）和Thermo Fisher的连接测序（SOLiD）为代表，通过桥式PCR或乳液PCR实现DNA片段的大规模扩增，在芯片或微珠表面形成数万个独立反应单元。以Illumina平台为例，荧光标记的可逆终止子dNTP在聚合酶作用下逐碱基掺入，每次循环读取荧光信号后切除终止基团，实现数百万条序列的同步测定。其核心优势为超高通量（单次运行可测Tb级数据）、多标记并行检测（支持STR、SNP、mtDNA等多重panel设计），但读长受限（150-300 bp），且依赖复杂的生物信息学分析去除PCR偏倚和测序错误。

Illumina 测序技术的流程较为复杂，首先要进行文库制备，将基因组DNA用超声波打断成小片段，然后使用酶将两端补平，再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基，以便连接特定接头序列。添加完接头序列后的DNA片段集合就构成了DNA文库。接着是成簇过程，这一过程在流动池（Flowcell）中完成。Flowcell是一片带有8条通道（lanes）的玻璃载玻片，每个通道内表面附有两种DNA引物。引物与DNA片段的接头序列互补配对，使DNA片段固定在通道表面，通过聚合酶生成杂交片段的互补片段。加入NaOH碱溶液使双链分子变性，洗去原始模板链，剩下的单链拷贝链另一端的接头与通道表面的引物结合形成单链桥，再经过多次循环扩增，形成数百万的簇，所有的DNA片段都会被克隆扩增。测序时，在Flowcell中加入荧光标记的dNTP和酶，由引物起始开始合成子链。由于dNTP存在3’端叠氮基会阻碍子链延伸，使得每个循环只能测得一个碱基。合成完一个碱基后，通入液体洗掉多余的dNTP和酶，使用显微镜的激光扫描特征荧光信号，根据荧光发射波长与信号强度确定碱基。不断重复这个过程，完成第一次读取。为了区分不同样本及正负链，构建DNA文库时会在接头序列加入不同index（或barcode） 。完成第一次读取后，复制出的链会被洗去，index片段引物被引入并与模板杂交，完成序列读取后被洗去，读取到的序列与已知index比对后给测得的序列贴上标签。若进行双末端测序，还需将模板链3’去保护，模板折叠，引入index片段，在聚合酶参与下形成双链桥，然后变性，切除并洗去正向链，只留下反向链，反向链以测序引物为起始，经过多个循环后完成读取。最后通过生物信息学分析，基于构建的index分类来自不同样本的序列，将具有相似延伸的碱基聚在一起，正向和反向read配对生成连续序列，并与参考基因组匹配，实现完整序列的构建。