三、从单一标记到多维分型的技术分野

一代测序技术：精准靶向检测的“金标准”应用

    在法医遗传学领域，一代测序技术凭借其高准确性和可靠性，在众多应用场景中发挥着关键作用，堪称精准靶向检测的“金标准”。

    在常规案件的处理中，一代测序技术，尤其是桑格测序法，是STR分型的核心技术。STR（短串联重复序列）作为人类基因组中广泛分布的遗传标记，具有高度多态性，在个体识别和亲权鉴定中至关重要。例如，CODIS（Combined DNA Index System，联合DNA索引系统）作为全球广泛应用的法医DNA数据库，其核心包含13个STR位点 。对于这些位点的单管扩增产物，桑格法能够直接、准确地读取等位基因长度。由于其单分子反应的高保真特性，误差率极低，通常小于0.1%。这使得在亲权鉴定中，可以通过比对STR位点的等位基因，精确判断亲子关系；在个体识别案件中，能够依据STR分型结果，将犯罪现场的生物证据与嫌疑人样本进行匹配，为案件侦破提供决定性证据。在一些简单的盗窃案中，警方从现场提取到嫌犯的毛发或血迹，通过对CODIS系统中13个核心STR位点进行桑格测序，若与嫌疑人样本的STR分型完全一致，即可锁定嫌犯身份。

    面对疑难样本时，一代测序技术也展现出独特优势。例如对于福尔马林固定组织、陈旧血迹这类降解样本，由于DNA已发生不同程度的降解，常规检测方法难以奏效。一代测序技术通过巢式PCR（Nested PCR）靶向扩增短片段（通常小于300bp），能够有效减少降解对检测的影响。巢式PCR采用两对引物，先使用一对外部引物进行第一轮扩增，再以第一轮扩增产物为模板，用内部引物进行第二轮扩增，大大提高了扩增的特异性和灵敏度。结合克隆测序技术，即将PCR扩增产物克隆到载体中，再对单个克隆进行测序，可有效规避异源污染干扰，确保检测结果的准确性。在单基因遗传病相关案件中，如产前诊断纠纷，一代测序技术对突变位点的精准定位能力无可替代。无论是点突变，还是小片段插入缺失，桑格测序都能通过对目标基因的直接测序，清晰呈现碱基序列变化，为案件判断提供关键依据。

    在法医遗传学检测中，质量控制至关重要。一代测序技术常作为二代测序数据的验证工具，用于确认NGS检测到的低频变异。嵌合体是指一个个体中存在两种或两种以上不同基因型的细胞群体，稀有SNP（单核苷酸多态性）则是频率较低的单个碱基变异。这些低频变异的准确检测对于案件结论至关重要。通过桑格测序，可对NGS检测结果进行验证。在分析Sanger峰图时，峰高比能直观反映等位基因比例。若NGS检测到某样本存在低频嵌合体情况，通过桑格测序验证，观察峰图中不同等位基因峰的高度比，可准确判断嵌合体细胞的比例，确保鉴定结论的可靠性，避免误判。

二代测序技术：复杂证据的多维解码平台

    随着犯罪现场证据的复杂性不断增加，二代测序技术凭借其高通量、多标记检测等优势，成为破解复杂生物证据的有力武器，构建起一个多维解码平台。

    二代测序技术在多标记联合检测方面实现了重大突破。在无名尸身源推断案件中，通过分析STR和SNP标记，结合数据库比对，可初步确定死者的身份信息；利用mtDNA高变区进行母系溯源，追溯死者的母系家族；根据与表型特征相关的SNP信息，还能推测死者的外貌特征，为案件侦破提供多维度线索。对于混合斑样本，传统方法难以有效拆分，而二代测序技术通过对多个遗传标记的综合分析，结合生物信息学算法，能够区分不同个体的DNA成分，实现混合斑样本的有效拆分，大大提高了检测的准确性和可靠性。

    在微量/降解样本检测方面，二代测序技术也展现出强大的优势。对于痕量生物检材，如接触性DNA（如犯罪现场门把手、凶器上极微量的皮肤细胞残留）、烟熏样本（火灾现场受高温影响的生物样本），由于DNA含量极低且可能存在降解，传统一代测序技术往往难以获得有效结果。二代测序技术采用多重扩增技术，可同时对多个目标区域进行扩增，提高了检测灵敏度。在处理高度降解的样本时，二代测序技术能通过单倍型分析解析高度降解的mtDNA全基因组。这为陈年旧案的侦破带来了新的希望，即使样本历经多年、DNA严重降解，也有可能从中获取关键遗传信息，推动案件侦破。

    二代测序技术还在转录组与表观遗传标记的探索应用中取得进展。通过RNA测序（RNA-seq），能够检测组织特异性基因表达谱。在犯罪现场发现的体液斑，若无法直观判断其类型，通过检测血液中的GAPDH（甘油醛- 3 -磷酸脱氢酶）、肌肉中的MYH7（肌球蛋白重链7）等组织特异性基因的表达情况，可准确推断体液斑类型，为案件分析提供重要线索。甲基化测序技术则致力于解析DNA甲基化模式与个体年龄、地域的关联。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，其模式会随着个体年龄增长和所处地域环境的不同而发生变化。通过研究DNA甲基化模式，有望为法医遗传学提供新的分析维度，如推断死者的年龄范围、生活地域等信息，进一步拓展法医遗传学的应用边界。